Полтавский Крестовоздвиженский монастырь был основан в 1650 году по инициативе полтавского полковника Мартина Пушкаря игуменом Лубенского Мгарского Спасского монастыря Калистратом. Кроме Мартина Пушкаря основными жертвователями при основании монастыря были казацкие войсковые старшины Иван Искра, Иван Крамарь и другие жители Полтавы. Разрешение и благословение на это дал Киевский митрополит Сильвестр Косое. Полтава многие века стояла на пути, по которому татарские орды совершали опустошительные набеги на украинские земли, сжигая города и увозя в неволю женщин и детей. Во время одного из таких набегов в 1695 году Крестовоздвиженский монастырь был разорен и предан огню. Накануне решающей битвы Великой Северной войны 1709 – 1721гг., по приказу короля Швеции Карла XII, штаб-квартира его армии была размещена в монашеских кельях монастыря. Монастырю принадлежало множество сел, среди которых были Рассошенцы, Буланово, Семеновка, Сторожевое, Ольшанка, несколько монашеских скитов. Восстановление сожженного и разграбленного монастыря в начале XVIII столетия осуществлялось усилиями полтавского полковника Василия Кочубея - сына казненного в 1708 году Генерального судьи Левобережной Украины Василия Леонтьевича Кочубея. Новый монастырь было решено построить из камня. Главный Крестовоздвиженский собор монастыря был освящен 11 февраля 1756 года. В соборе было два престола : главный, в честь воздвижения Креста Господнего, и боковой, в честь Благовещения Пресвятой Богородицы. Особо был красив резной иконостас во всю высоту храма, выполненный в середине XVIII ст. известным резчиком по дереву Сысоем Шалматовым. Кроме соборной церкви, на территории монастыря располагалась одноярусная с одним куполом трапезная церковь во имя святой Троицы, построенная в 1750 году. В 1887 году она была разобрана в связи с постройкой отдельной трапезной церкви во имя Симеона Богоприимца. Храм этот был сооружен на средства иркутского купца Иннокентия Котельникова в память его сына, умершего в Полтаве и похороненного в монастыре. С западной стороны храма была пристроена пекарня и келия заведующего трапезой монаха. В 1775 году императрица Екатерина II повелела всем архиепископам Славянским и Херсонским жить в Полтаве, в Крестовоздвиженском монастыре. Среди них наиболее известным был архиепископ Амвросий (Антоний Серебренников). Его труды по вопросам христианства, проповеди и речи печатались в различных епархиальных ведомостях и журнале "Северная пчела". Похоронен архиепископ Амвросий был в монастыре, где его тело почивало нетленным.

Колокольня Крестовоздвиженского монастыря была построена в 1786 году при архиепископе Славянском и Херсонском Никифоре Феотоки и имела высоту около 45 метров. Своим величественным видом эта колокольня напоминает колокольню Киево-Печерской лавры. В среднем ярусе колокольни был устроен престол во имя Печерской иконы Божьей Матери. Самый большой из ее колоколов весил 400 пудов и был отлит в 1797 году. На колоколе была надпись: "Божиею помощью при державе Благочестивейшия Екатерины Второй, благословением преосвященного Гавриила, митрополита Екатеринославского и Херсониса-Таврического, сей колокол вылит в Полтавский Крестовоздвиженский монастырь коштом того же монастыря 1797 года июля 15 дня". Особый интерес для историков представляет деревянный дом настоятеля монастыря, построенный в 1855 году усилиями митрополита Феофила Красноуглова на каменном фундаменте. В доме было семь комнат, и располагался он примерно в 20 метрах от соборного храма. К этому зданию был пристроен большой летний зал с восемью окнами, имевший размер около 22 метров в длину и 18 метров в ширину, с большим и просторным балконом, с которого открывался чудесный вид на предместья Полтавы. Вместо обоев на стенах зала были расположены картины, выполненные на библейские темы либо на холсте, либо на деревянных досках. Над входными дверями зала находилась картина, изображающая Воскресенский храм в Иерусалиме. При перестройке этого дома в 1854 году строители предполагали снести зал, однако по настоянию тогдашнего Малороссийского генерал-губернатора С.А.Кокошина он был восстановлен в первоначальном виде. В 1892г. все картины за ветхостью были уничтожены, а сам зал был перестроен под ризницу. Каменная ограда монастыря была сооружена за период с 1881 по 1887 год. С юго-восточной стороны монастыря стоял небольшой одноэтажный дом с 8 братскими кельями и отделением для больницы, также построенный иркутским купцом Иннокентием Котельниковым. Еще несколько зданий монастыря были построены на частные пожертвования.

После основания монастыря, с 1650 г. по 1652 г. им управлял наместник. С 1652г. по 1775 г. монастырем руководили игумены, а после 1775 г. и по 1798 г. — епископы Славянские и Херсонские. После восстановления Переяславской епархии и до 1884 года монастырем руководили архимандриты. Указом Священного Синода в 1803 году им были переданы особые полномочия, позаимствованные из архиерейского чина: употребление во время службы длинных специальных свечей — дикирия и трикирия. Поскольку Крестовоздвиженскому монастырю было поручено ведать устроенной на поле Полтавской битвы братской могилой русских воинов и Сампсониевской церковью, то все настоятели Крестовоздвиженского монастыря были обязаны носить на скрижалиях своей мантии изображение святого Георгия Победоносца и преподобного Сампсония Странноприимца.

В монастыре в начале века находились два ковчега с частицами мощей святых угодников. Однако главной святыней монастыря была чудотворная икона Скорбящей Божьей Матери, которая именовалась "Упование всех концов земли". Икона эта была написана в 1821 году на стене в среднем ярусе колокольни иноком Даниилом Московченко. К образу этому приходили многие больные, для которых возле него служились молебны с водоосвящением. Известно также, что находившиеся в монастыре нетленные мощи архиепископа Амвросия Серебренникова и епископа Афанасия Вольховского подавали благодатное исцеление всем с верою просящим у них помощи.

В смутное время 1918-1921гг., когда власть в городе более десяти раз переходила из рук в руки, монастырь не раз становился объектом для бандитских грабежей. С первых лет Советской власти, в соответствии с многочисленными декретами, производилось изъятие золотой и серебряной церковной утвари. За период с 1917 по 1919 год был практически полностью вырублен знаменитый монастырский дубовый лес. Во время немецкой оккупации Полтавы летом 1918 года при монастыре была открыта небольшая амбулаторная больница. После окончательного прихода большевиков к власти, в 1923 году монастырь был закрыт. В помещениях монастыря разместились клуб поселка железнодорожников и губернский архивный склад. С 1933 года и до конца 30-х годов в монастыре размещалась детская трудовая колония для сирот и беспризорных. В конце 30-х годов бывшие келии монастырю были Полтавскому государственному педагогическому институту и в них были оборудованы общежитие, столовая и квартиры для преподавателей. Во время немецкой оккупации 1942 – 1943гг. община монахинь получила разрешение открыть в уцелевших помещениях женский монастырь. В послевоенные годы монастырь начал постепенно отстраиваться за счет церкви и частных пожертвований. В ноябре 1958 года Полтавский облисполком принял решение о ликвидации Полтавского Крестовоздвиженского монастыря и передаче его помещений Полтавскому государственному педагогическому институту. 48 монахинь и основное имущество монастыря были вывезены 8 июля 1960 года в Лебединский Николаевский монастырь (Черкасская область), а монахинь разместили по домам престарелых или передали родственникам. Решением местной власти со всех монастырских зданий были сняты кресты. В 80-е годы было окончательно уничтожено монастырское кладбище, на котором были похоронены многие выдающиеся полтавчане и простые жители города.

После провозглашения независимости Украины в 1991 году монастырь возобновил свою деятельность.